作者：蔡雨镝，谢旭东，吴亚菲，四川大学华西口腔医院
牙周炎是发生在牙周支持组织上的慢性感染性疾病，可造成牙周软硬组织的丢失。牙周炎的治疗目标是控制感染并使牙周组织再生。牙周组织再生的难点之一是如何精准调控不同牙周软硬组织的矿化过程，形成复杂的矿化与非矿化的有序结构。
无机焦磷酸盐(inorganic pyrophosphate， PPi)作为一种钙磷沉积的抑制剂，是组织矿化的重要调节因子，不仅参与调节矿化组织发育，还抑制软组织(如血管)异常钙化，其表达变化与病理钙化的发生发展密切相关。研究显示，骨硬化症患者的血浆内PPi水平显著下降，补充外源性PPi可能作为骨硬化症的治疗策略。近年来，研究发现PPi广泛参与调控牙周组织的矿化。
1. PPi及其调控因子调节组织矿化的作用
PPi由两分子无机磷酸盐(inorganic phosphate， Pi)组成，由胞外三磷酸
体内PPi的浓度平衡受到多种转运因子和酶的调控：
①组织非特异性碱性磷酸酶(tissue nonspecific alkaline phosphatase， TNALP)作为一种磷酸单脂酶，在牙和骨等矿化组织中高表达，能水解PPi产生Pi， 与钙离子结合形成羟基磷灰石(hydroxyapatite， HA)，调控组织矿化过程。研究显示，在含有PPi的成骨细胞培养基中加入外源性的TNALP，能削弱PPi的矿化抑制作用，但是TNALP并不能水解已经和矿物质结合的PPi。
②进行性强直蛋白(progressive ankylosis protein， ANK)作为跨膜蛋白，具有直接转运PPi的功能，能将胞内的PPi转运至胞外，增加局部PPi的水平。
③ENPP1也是一种跨膜蛋白，能水解核苷酸及其衍生物的焦磷酸酯键/磷酸二酯键，可将ATP水解为PPi，从而提高局部PPi的水平。
研究显示，PPi通过多种途径调节矿化：①PPi一方面直接与HA结合抑制HA晶体的生长；另一方面，PPi被酶水解成两分子的Pi，为HA的形成提供合成底物，促进矿化组织的形成。②PPi还通过细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases， ERK)1/2和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase， p38 MAPK)信号通路上调矿化抑制剂骨桥蛋白(osteopontin， OPN)的表达，间接调控矿化。③PPi不仅可被TNALP水解，还可通过负反馈对TNALP的酶活性发挥抑制作用。
2. PPi及其调控因子对牙周组织的矿化调节作用机制
2.1 PPi及其调控因子对牙槽骨的矿化调节作用
大量研究显示，PPi及其调控因子在骨矿化和骨吸收过程中均发挥重要调控作用。
细胞实验进一步证实，降低Pi/PPi比例会导致OPN和Ⅰ型胶原α1表达上升，从而抑制矿化；相反，升高Pi/PPi比例会提高成骨向蛋白牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1，DMP1)和成骨细胞特异性转录因子Osterix(Osx)的表达。同时，PPi及其调控因子也参与调控骨吸收过程。
PPi的跨膜转运蛋白ANK在破骨细胞形成过程中发挥正向调控作用，ANK蛋白功能丧失可导致抗酒石酸
与其他骨骼相比，牙槽骨表现为高度的可塑性，是全身骨骼中改建最活跃的区域。研究显示，局部注射搭载TNALP的腺相关病毒8编码TNALP-D10可扭转HPP患者的颌骨发育缺陷。然而，通过调控PPi的浓度在牙槽骨再生中的作用仍存在争议。
研究显示，尽管ANK和ENPP1基因敲除小鼠颌骨缺损中骨基质蛋白(DMP1、OPN等)表达上调，成骨活动更为活跃，但TRAP+细胞以及组织蛋白酶K+的破骨细胞数量也显著增加，破骨活性增强，导致牙槽骨愈合受阻，这与在长骨中观察到的现象并不一致，相关机制尚待阐明。
2.2 PPi及其调控因子对牙骨质的矿化调节作用
牙骨质与牙槽骨关系密切，两者的紧密连接是将牙齿固定在牙槽窝的必要条件。根据牙骨质中是否还有牙骨质细胞，可以将牙骨质分为细胞牙骨质和无细胞牙骨质。其中，无细胞牙骨质与固有牙槽骨有相似的结构和非胶原蛋白成分，两者表面均含有丰富的OPN，对局部的组织矿化起到重要的调控作用。不仅如此，PPi的调控因子ANK和ENPP1对牙槽骨和牙骨质的矿化都有显著的影响。
另外，相对于牙槽骨，牙骨质通过沉积的方式生长，且改建能力弱，不易再生，两者对PPi的反应也存在差异。成牙骨质细胞对PPi的浓度变化较为敏感，PPi上升可导致无细胞外源性纤维牙骨质(acellular extrinsic fiber cementum， AEFC)形成受阻，而PPi减少则可引起牙骨质厚度增加；同时，PPi的调控因子TNALP、ANK和ENPP1也在成牙骨质细胞的矿化过程中高表达。这从一定程度上解释了为何牙骨质对PPi的响应相较于其他牙周组织更灵敏。
在颌骨损伤模型中，ANK和ENPP1基因敲除小鼠牙骨质再生均优于对照组，且ANK和ENPP1基因的缺失对牙骨质形成的促进作用存在叠加效应，即双基因敲除小鼠牙骨质再生效果优于单一基因敲除组。TNALP缺陷的患者由于牙骨质矿化受阻可出现牙根发育不全，甚至牙早失。而ANK和ENPP1在成牙骨质细胞中的表达存在互补，即ENPP1在ANK敲除样本中上调，ANK在ENPP1敲除后上调。成牙骨质细胞对PPi及其相关调控因子的高敏感性为靶向调控牙骨质再生提供可能。
除了直接控制牙骨质的矿物沉积，PPi还影响牙骨质ECM蛋白的组成。OPN和DMP1都是调节矿化的小整合素结合配体N-连结糖蛋白(small-integrin-binding ligand， n-linked glycoprotein， SIBLING)家族成员，两者在ANK和ENPP1基因敲除后均高表达。
值得注意的是，不同类型的牙骨质对PPi的响应也存在差异，牙颈部的AEFC更易受到PPi浓度变化的影响，而位于根尖的细胞牙骨质受影响较小。研究显示，采用PPi类似物可完全抑制无细胞牙骨质的形成，而细胞性牙骨质的形成并未受到影响。
另外，在根尖区域的细胞牙骨质中，未观察到ANK和ENPP1的持续表达和补偿效应，造成AEFC发育缺陷，同时不影响细胞内源性纤维牙骨质的表型，提示PPi及其调控因子在牙骨质形成过程中参与调节无细胞牙骨质矿化。
以上实验结果表明，PPi及其调控因子通过抑制HA形成和影响ECM蛋白组成等多种途径调控特定类型牙骨质(主要是无细胞牙骨质)的矿化过程，探究PPi的调控机制为牙骨质再生提供新思路。
2.3 PPi及其调节因子对牙周膜的矿化抑制作用
牙周膜是连接牙槽骨和牙骨质的致密结缔组织，一方面参与牙周硬组织的形成和改建，另一方面发挥着一定的矿化抑制作用，防止骨和牙根的粘连。牙周膜的矿化平衡是牙周组织维持结构和功能稳定的必要前提。研究发现，牙周膜的矿化与血清Pi平衡关系密切。成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor 23，FGF23)作为Pi和钙稳态的重要调节剂，可作用于肾脏促进Pi排泄，从而影响血清Pi平衡。
FGF23基因敲除小鼠由于Pi的排泄受阻，引起血清Pi浓度升高，使得牙周膜矿化失衡，进而导致牙周膜宽度减少。低磷酸血症小鼠使用FGF23抗体后，改善增宽的牙周膜。
此外，PPi相关调节因子在牙周膜再生过程中同样发挥重要调控作用。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells， PDLSCs)是牙周膜再生的细胞来源，在利用PDLSCs再生牙周膜的过程中，预防其过度矿化是实现牙周组织功能性再生的关键。研究显示，PPi可抑制PDLSCs的成骨向分化和矿化过程，具体表现为成骨向RNA和蛋白(Runt相关转录因子2、Osx和DMP1)表达的下调，矿化结节形成减少和ALP活性降低。
与成骨细胞和成牙骨质细胞相比，PPi对PDLSCs的矿化抑制时间更长，且抑制时间与PPi浓度成正比。研究进一步发现，PPi可上调MAPK通路(ERK1/2、c-Jun氨基末端激酶和p38)的磷酸化水平，而阻断MAPK通路能够逆转PPi的成骨抑制作用。有趣的是，该研究发现PPi浓度升高还能下调ALP基因，并升高ANK基因的表达，进一步抑制PDLSCs的矿化。
以上研究表明PPi通过MAPK信号通路对PDLSCs的矿化发挥抑制作用，同时PPi及其相关调节因子的平衡受到FGF23的调控。阐明PPi在PDLSCs分化和矿化中的作用有利于加深对牙周膜稳态的认识，为牙周膜的再生奠定理论基础。
3. 总结与展望
PPi作为重要的矿化调控因子，其合成和水解与组织矿化过程密切相关。鉴于PPi及其相关调控因子在牙槽骨、牙骨质和牙周膜矿化调节中均发挥作用，如何控制PPi和相关调控因子调节不同牙周组织的有序矿化，是亟需解决的一个重要问题，相关研究有助于实现牙周组织的功能性再生。
然而，传统组织工程技术中，通常将复合干细胞的生物材料直接植入牙周缺损中，难以实现对不同牙周组织的差异化调控而形成牙固连。多相支架同时具备多种内部结构和/或多种生化成分，广泛应用于骨-软骨、牙周复合体等复杂修复领域。
利用多相支架功能成分的多样性和差异性有益于重建不同组织界面的结构与功能关系。因此，构建牙周多相支架并设置PPi或其调控因子在生物支架不同部位的浓度梯度，从而实现针对特定组织的差异化矿化调节，可能是牙周组织再生领域未来的研究方向之一。
来源：蔡雨镝,谢旭东,吴亚菲.无机焦磷酸盐及其相关调控因子对牙周支持组织的矿化调控作用[J].口腔生物医学,2024,15(01):49-52.
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